Микроорганизмы встречаются в самых неподходящих, на наш взгляд, экологических нишах. Так, некоторые виды бактерий (Bacillus submarinus) способны жить в океанах на глубине более 5000 м, выдерживая гидростатическое давление свыше 3,1–10 8 Па, экстремально термофильные бактерии Thermus aquaticus выделяются из воды и илов горячих источников, температура которых достигает 92° С, крайние галофильные бактерии обнаружены в воде Мертвого моря.
Определенные факторы среды могут различно влиять на микроорганизмы, действовать на них угнетающе либо вызывать гибель микробной популяции. Положительный или отрицательный эффект действующего фактора обусловлен как природой самого фактора, так и свойствами микроорганизма.
Влажность. Наличие влаги обусловливает уровень процессов метаболизма в клетке, поступление в нее веществ питательного субстрата, энергию роста и размножения бактерий.
Большинство бактерий при влажности среды свыше 20% развиваются нормально.
Высушивание бактерий приводит к обезвоживанию цитоплазмы клетки, почти полному прекращению процессов метаболизма и в конечном итоге к переходу микробной клетки в состояние анабиоза. Использование высушивания применяется при хранении пищевых продуктов.
Часто и в условиях глубокого иссушения бактерии сохраняют жизнеспособность. Так, микобактерии туберкулеза сохраняют жизнеспособность в высохшей мокроте больного более 10 месяцев, споры бацилл сибирской язвы в сухом состоянии выживают до 10 лет. Метод сублимаций (высушивания) в настоящее время широко применяется для длительного хранения живых вакцин против туберкулеза, чумы, оспы, гриппа, а также для содержания производственных и музейных культур микроорганизмов.
Температура. Жизнедеятельность прокариот непосредственно зависит от температурного диапазона. Он характеризуется тремя кардинальными точками: минимальная температура, ниже которой прекращается рост и развитие бактерий; оптимальная температура, соответствующая наивысшей скорости роста микроба, максимальная температура, выше которой скорость роста бактерий практически снижается до нуля. На основании температурного диапазона все прокариоты подразделяются на 3 группы: психрофилы, мезофилы и термофилы.
Психрофилы (от греч. psychros – холод, phileo – люблю) представлены бактериями, развивающимися при низких температурах от – 5 до 20–35 0 С. Среди них выделяют подгруппу облигатных психрофилов, неспособных расти при температуре выше 20 °С. Это бактерии глубоких озер, северных морей и океанов. Вторую весьма обширную подгруппу составляют факультативные психрофилы – бактерии, приспособившиеся к действию переменных температур от – 5 °С до 20–35 °С, населяют зону умеренного климата.
Низкие температуры замедляют в клетке процессы метаболизма, на этом основано использование холодильников, погребов и ледников для хранения пищевых продуктов. Многие микроорганизмы в толще природных льдов способны пребывать в состоянии анабиоза «захороненными» до 12000 лет.
К мезофилам (от греч. mesos – средний) относится подавляющая масса прокариот, для которых температурный диапазон лежит в пределах 10–47° С, при оптимальных температурах 30–40° С. В эту группу входят многие патогенные бактерии, вызывающие заболевания теплокровных животных и человека.
Термофилы (от греч. thermos – тепло, жар) составляют разнообразную группу бактерий, растущих в температурном диапазоне от 10 до 55–60° С. Факультативные термофилы, одинаково успешно развиваются как при температуре 55–60° С, так и при 10–20° С, и облигатные термофилы, не способные к росту при температуре ниже 40° С. Экстремальные термофилы живут при температуре выше 70° С. Они выделены из горячих источников и отнесены к родам Thermomicrobium, Thermus, Thermothrix и др. Особую стойкость к высокой температуре проявляют споры бактерий, выдерживающие температуру кипения в течение двух-трех часов.
Лучистая энергия . Различные виды излучений по разному влияют на бактерии. Инфракрасное излучение (длины волн от 760 нм до 400 мкм) не способно вызвать какие-либо существенные фотохимические изменения в живых клетках. Рентгеновские лучи (длины волн менее 10 нм) ионизируют макромолекулы живых клеток. Возникающие фотохимические изменения вызывают развитие мутаций либо гибель клетки. Отдельные виды бактерий обладают поразительной устойчивостью к действию рентгеновских лучей. Это тионовые бактерии, обитающие в залежах урановых руд, а также бактерии Micrococcus radiodurans, выделяемые из воды атомных реакторов при дозе ионизирующего излучения в 2–3 млн. рад.
Видимый свет (длины волн от 380 до 760 нм) оказывает благоприятное влияние только на развитие фотосинтезирующих бактерий.
Сильным эффектом обладают ультрафиолетовые лучи с длиной волны 253,7 нм. На бактерицидном действии ультрафиолетовых лучей на бактерии основано использование их для обеззараживания продуктов питания, питательных сред, посуды, а также дезинфекции палат, операционных, помещений родильных домов.
Ультразвук. Ультразвук – высокочастотные колебания звуковых волн (более 20000 Гц). Ультразвук оказывает мощное бактерицидное действие на прокариоты. Сила этого действия зависит от частоты колебаний, длительности воздействия, а также от физиологического состояния и индивидуальных особенностей микроорганизма. При длительном озвучивании микробной культуры наблюдается 100%-ный летальный эффект.
Действие ультразвука заключается в необратимых физико-химических изменениях компонентов микробной клетки и механических повреждениях всех клеточных структур. В настоящее время ультразвук применяют для стерилизации пищевых продуктов, лабораторного оборудования и вакцин.
Реакция среды. Реакция среды является одним из важных факторов, определяющих развитие бактерий, влияет на растворимость веществ питательного субстрата и поступление их в клетку. Изменение реакции среды нередко сопровождается повышением концентрации токсических соединений.
Прокариоты по отношению их к кислотности среды могут быть разделены на несколько групп. Подавляющее большинство их относятся к нейтрофилам, для которых оптимальна нейтральная среда. В этой группы многие бактерии способны проявлять кислотоустойчивость или щелочеустойчиость.
Среди прокариот имеются ацидофилы,
развивающиеся в кислой среде со значением рН 2–3. К умеренным ацидофилам относятся бактерии, обитающие в воде кислых болот и озер, а также в кислых почвах при
рН 3–4. Крайними ацидофилами являются бактерии родов Thiobacillus и Sulfomonas, а также Thermoplasma acidophila.
Алкалофильные бактерии сушествуют в щелочной среде. К алкалофильным бактериям относятся представители рода Bacillus и холерный вибрион, размножение которого возрастает при значении рН выше 9.
На отрицательном влиянии повышенной кислотности среды на большинство микроорганизмов основано применение маринадов.
Кислород. Большинство прокариот для жизнедеятельности нуждаются в кислороде и носят название облигатных (строгих) аэробов.
Облигатные аэробы способны выдерживать концентрацию кислорода порядка 40–50%. Бактерии, для которых молекулярный кислород необходим в незначительных количествах – не более 2%, получили название микроаэрофилов.
Вторую группу прокариот составляют микроорганизмы, для жизнедеятельности которых молекулярный кислород не нужен. Такие микроорганизмы получили название облигатных анаэробов. К ним относятся маслянокислые, метанобразующие, сульфатвосстанавливающие и некоторые другие бактерии. В клетках облигатных анаэробов окисление веществ субстрата происходит без участиякислорода. К ним относятся представители родов Methanobacterium, Methanosarcina, Fusobacterium и др.
Многие виды маслянокислых бактерий проявляют устойчивость к молекулярному кислороду и носят название аэротолерантных. Примером аэротолерантов являются бактерии рода Clostridium. Особую аэротолерантность проявляют эндоспоры маслянокислых бактерий. Прокариоты, способные расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях и переключать свой энергетический метаболизм с одного способа получения энергии на другой, получили название факультативных аэробов или факультативных анаэробов. Примером факультативных анаэробов являются денитрифицирующие и десульфофицирующие бактерии, а также обширная группа энтеробактерий.
Антисептики. Химические соединения, оказывающие губительное действие на микроорганизмы, получили название антисептиков.
Действие антисептика на бактерии может быть бактериостатическим или бактерицидным. Бактериостатическое действие лишь прекращает рост и размножение микробных клеток; бактерицидное – вызывает гибель бактерий, что нередко сопровождается лизисом клеток. Получаемый эффект зависит от самой природы химических соединений, их концентрации, от продолжительности действия антисептика на микроорганизмы, а также от сопутствующих факторов среды – температуры, величины рН и т.д.
Антисептики представлены различными органическими и неорганическими соединениями. Из неорганических соединений сильными антисептиками являются соли тяжелых металлов – ртути (сулема), свинца, серебра, цинка и др. Соли ртути, серебра, мышьяка проявляют сильное ингибирующее действие на ферменты микробной клетки. Даже в незначительных концентрациях 1:1000 соли тяжелых металлов вызывают гибель большинства бактерий в течение нескольких минут.
Из органических соединений антисептическим действием обладают этиловый и изопропиловый спирты (70%-ные растворы), фенол, крезол и их производные, формальдегид. Особенно широкое применение находит фенол (карболовая кислота). Большинство микробов погибают от действия 1–5%-ного раствора карболовой кислоты. Сильным антисептиком является формальдегид.
Влияние физических факторов .
Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) - мезофилами, при высокой - термофилами.
К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов - обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при температуре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свойства бактерий меняются. Интервал температур, при котором возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум - от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.
Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10- 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.
При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250-300 °С и давлении 262 атм.
Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как показатель загрязненности почвы.
Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (-173 °С).
Высушивание . Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.
Высушивание под вакуумом из замороженного состояния - лиофилизацию - используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.
Действие излучения . Неионизирующее излучение - ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение - гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабораториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200-450 нм.
Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была выделена из ядерного реактора.
Действие химических веществ . Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.
Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим соединениям и окислителям.
Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли).
Стерилизация – предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергшихся обработке.
Дезинфекция - процедура, предусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтожения до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании данного предмета. Как правило, при дезинфекции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии.
Асептика – комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для борьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители.
Антисептика – совокупность мер, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалительного процесса.
Дисбиозы. Препараты для восстановления микробиоты. Состояние эубиоза - динамического равновесия нормальной микрофлоры и организма человека - может нарушаться под влиянием факторов окружающей среды, стрессовых воздействий, широкого и бесконтрольного применения антимикробных препаратов, лучевой терапии и химиотерапии, нерационального питания, оперативных вмешательств и т. д. В результате нарушается колонизационная резистентность. Аномально размножившиеся транзиторные микроорганизмы продуцируют токсичные продукты метаболизма - индол, скатол, аммиак, сероводород.
Состояния, развивающиеся в результате утраты нормальных функций микрофлоры, называются дисбактериозом и дисбиозом .
При дисбактериозе происходят стойкие количественные и качественные изменения бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры. При дисбиозе изменения происходят и среди других групп микроорганизмов (вирусов, грибов и др.). Дисбиоз и дисбактериоз могут приводить к эндогенным инфекциям.
Дисбиозы классифицируют по этиологии (грибковый, стафилококковый, протейный и др.) и по локализации (дисбиоз рта, кишки, влагалища и т. д.). Изменения в составе и функциях нормальной микрофлоры сопровождаются различными нарушениями: развитием инфекций, диарей, запоров, синдрома мальабсорбции, гастритов, колитов, язвенной болезни, злокачественных новообразований, аллергий, мочекаменной болезни, гипо- и гиперхолестеринемии, гипо- и гипертензии, кариеса, артрита, поражений печени и др.
Нарушения нормальной микрофлоры человека определяются следующим образом:
1. Выявление видового и количественного состава представителей микробиоценоза определенного биотопа (кишки, рта, влагалища, кожи и т. д.) - путем высева из разведений исследуемого материала или путем отпечатков, смыва на соответствующие питательные среды (среда Блаурокка - для бифидобактерий; среда МРС-2 - для лактобактерий; анаэробный кровяной агар - для бактероидов; среда Левина или Эндо - для энтеробактерий; желчно-кровяной агар - для энтерококков; кровяной агар - для стрептококков и гемофилов; мясопептонный агар с фурагином - для синегнойной палочки, среда Сабуро - для грибов и др.).
2. Определение в исследуемом материале микробных метаболитов - маркеров дисбиоза (жирных кислот, гидроксижирных кислот, жирнокислотных альдегидов, ферментов и др.). Например, обнаружение в фекалиях бета-аспартилглицина и бета-аспартиллизина свидетельствует о нарушении кишечного микробиоценоза, так как в норме эти дипептиды метаболизируются кишечной анаэробной микрофлорой.
Для восстановления нормальной микрофлоры: а) проводят селективную деконтаминацию; б) назначают препараты пробиотиков (эубиотиков), полученные из лиофильно высушенных живых бактерий - представителей нормальной микрофлоры кишечника - бифидобактерий (бифидумбактерин), кишечной палочки (колибактерин), лактобактерий (лактобактерин) и др.
Пробиотики - препараты, оказывающие при приемеper os нормализирующее действие на организм человека и его микрофлору.
Пребиотики – различные вещества, которые служат для питания представителей норм. Микробиоты и и улучшения моторики кишечника. Эубиотики – культуры м/о, относяиеся к представителям нормальной микробиоты кишечника. Например – лактобактерин, витофлор, линекс.
Иммерсионный микроскоп. Иммерсионная микроскопия (отлат. immersio - погружение) - методмикроскопического исследования малых объектов с помощью погруженияобъектива светового микроскопа в среду с высокимкоэффициентом преломления , расположенную междумикроскопическим препаратом и объективом.
Для проведения исследований используют специальные иммерсионные объективы (объективы для масляной иммерсии имеют чёрную полосу на оправе, вблизи от фронтальной линзы; объективы для водной иммерсии - белую полосу ).
Жидкостная иммерсия
Для иммерсионной микроскопии применялись различные жидкости. Наибольшее распространение нашли кедровое масло (показатель преломления n=1,515), глицерин (n=1,4739) и вода (дистиллированная , n=1,3329). Физиологический раствор имеет n=1,3346.
Водная иммерсия. На практике «водная иммерсия» широко применялась ещё до изобретения самого понятия иммерсия , когда объектив микроскопа , для наблюдения за обитателями прудов или луж, полностью погружали в воду. Это позволяет увеличить разрешающую способность объектива и микроскопической системы в целом.
Для исследований в световой микроскопии широко применяются специальные объективы для водной иммерсии , имеющие повышенную числовую апертуру , за счёт того, что показатель преломления воды выше, чем у воздуха.
Масляная иммерсия. Традиционно в качестве среды для масляной иммерсии применяется кедровое масло. Однако оно имеет существенный недостаток: по мере постепенного окисления на воздухе, оно густеет, желтеет и постепенно превращается в слишком вязкую тёмную жидкость.
11.История микробиологии. Этапы. Задачи. Историю развития микробиологии можно разделить на пять этапов: эвристический, морфологический, физиологический, иммунологический и молекулярно-генетический.
Пастер сделал ряд выдающихся открытий. За короткий период с 1857 по 1885 г. он доказал, что брожение (молочнокислое, спиртовое, уксуснокислое) не является химическим процессом, а его вызывают микроорганизмы; опроверг теорию самозарождения; открыл явление анаэробиоза, т.е. возможность жизни микроорганизмов в отсутствие кислорода; заложил основы дезинфекции, асептики и антисептики; открыл способ предохранения от инфекционных болезней с помощью вакцинации.
Многие открытия Л. Пастера принесли человечеству огромную практическую пользу. Путем прогревания (пастеризации) были побеждены болезни пива и вина, молочнокислых продуктов, вызываемые микроорганизмами; для предупреждения гнойных осложнений ран введена антисептика; на основе принципов Л. Пастера разработаны многие вакцины для борьбы с инфекционными болезнями.
Однако значение трудов Л. Пастера выходит далеко за рамки только этих практических достижений. Л. Пастер вывел микробиологию и иммунологию на принципиально новые позиции, показал роль микроорганизмов в жизни людей, экономике, промышленности, инфекционной патологии, заложил принципы, по которым развиваются микробиология и иммунология и в наше время.
Л. Пастер был, кроме того, выдающимся учителем и организатором науки.
Работы Л. Пастера по вакцинации открыли новый этап в развитии микробиологии, по праву получивший название иммунологического.
Принцип аттенуации (ослабления) микроорганизмов с помощью пассажей через восприимчивое животное или при выдерживании микроорганизмов в неблагоприятных условиях (температура, высушивание) позволил Л. Пастеру получить вакцины против бешенства, сибирской язвы, куриной холеры; этот принцип до настоящего времени используется при приготовлении вакцин. Следовательно, Л. Пастер является основоположником научной иммунологии, хотя и до него был известен метод предупреждения оспы путем заражения людей коровьей оспой, разработанный английским врачом Э. Дженнером. Однако этот метод не был распространен на профилактику других болезней.
Роберт Кох . Физиологический период в развитии микробиологии связан также с именем немецкого ученого Роберта Коха, которому принадлежит разработка методов получения чистых культур бактерий, окраски бактерий при микроскопии, микрофотографии. Известна также сформулированная Р. Кохом триада Коха, которой до сих пор пользуются при установлении возбудителя болезни.
Задачи. - изучение биологических свойств болезнетворных организмов - разработка методов диагностики вызываемых видов заболеваний - разработка методов борьбы болезнетворными м/о - создание методов стимуляции м/о, полезных для человека
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра, называемого нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры.
Клеточная стенка . В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos - стенка).
В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид.
Функции клеточной стенки :
Обусловливает форму клетки.
Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление.
Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества.
Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.
Метод выявления клеточной стенки - электронная микроскопия, плазмолиз.
L-формы бактерий, их медицинское значение L-формы - это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки (протопласт +/- остаток клеточной стенки), поэтому имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток. Способны к размножению.
14.Методы культивирования вирусов. Вирусологический метод. Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий - облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.
Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.
Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты - реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.
Другой метод - реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.
Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток . Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6-7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.
Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек .
Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям , которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.
Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8-12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.
О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.
К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.
Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки - к вирусам Коксаки).
Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования. Вирусологический метод включает культивирование вирусов, их индикацию и идентификацию. Материалами для вирусологического исследования могут быть кровь, различные секреты и экскреты, биоптаты органов и тканей человека. Исследование крови часто проводят в целях диагностики арбовирусных заболеваний. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителя гриппа, кори, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено-, рео- и ротавирусы. Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных. Источник получения клеток - ткани, извлечённые у человека при операции, органы эмбрионов, животных и птиц. Используют нормальные или злокачественно перерождённые ткани: эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Вирусы человека лучше размножаются в культурах клеток человека или почечных клеток обезьян. Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности. Например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, что определяет необходимость подбора соответствующей культуры. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментное заражение 3-4 культур клеток, так как одна из них может оказаться чувствительной. 15. Методы микроскопии (люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная).
Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции.
Люминесценция - свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: световых, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция - люминесценция объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Люминесцентный метод микроскопии занимает важное место в исследовании микроорганизмов. Люминесценцией (или флюоресценцией) называют излучение клеткой света за счет поглощенной энергии. Только немногие бактерии (люминесцирующие) способны светиться собственным светом в результате интенсивных процессов окисления, протекающих у них со значительным выделением энергии.
Большинство микроорганизмов приобретает способность люминесцировать, или флюоресцировать, при освещении их ультрафиолетовыми лучами после предварительной окраски специальными красителями - флюорохромами. Поглощая короткие ультрафиолетовые волны, объект излучает более длинные волны видимой части спектра. Вследствие этого разрешающая способность микроскопа повышается. Это дает возможность исследовать более мелкие частицы. Чаще используют красители- флюорохромы: акридин оранжевый, аурамин, корифосфин, флюоресцеин в виде очень слабых водных растворов.
При окраске корифосфином коринебактерии дифтерии дают желто-зеленое свечение в ультрафиолетовом свете, микобактерии туберкулеза при окраске аурамин-родамином - золотисто-оранжевое. Для успешной микроскопии необходим яркий источник света, в качестве которого используют ртутно-кварцевую лампу высокого давления. Между источником света и зеркалом помещают сине-фиолетовый светофильтр, который пропускает только короткие и средние волны ультрафиолетового света. Попав на объектив, эти волны возбуждают в нем люминесценцию. Чтобы увидеть ее, на окуляр микроскопа надевают желтый фильтр, который пропускает длинноволновый свет флюоресценции, возникающий при прохождении лучей через объект. Короткие волны, не поглощенные исследуемым объектом, убираются, отсекаются этим фильтром.
Существуют специальные люминесцирующие микроскопы МЛ-1, МЛ-2, MЛ-3, а также простые устройства: комплект ОИ-17 (опакиллюминатор), ОИ-18 (осветительное устройство с ртутно-кварцевой лампой СВД-120А), дающие возможность применять для люминесцентной микроскопии обычный биологический микроскоп.
Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе. Исследование микроорганизмов в темном поле (темнопольная микроскопия) основано на явлениях рассеяния света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости частиц. Микроскопия в темном поле зрения позволяет увидеть более мелкие частицы, чем в световом микроскопе. Она осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, снабженного специальными конденсорами (параболоид- или кардиоид-конденсор), который создает полый конус света. Вершина этого полого конуса совпадает с объектом. Лучи света, проходя через объект исследования в косом направлении, не попадают в объектив микроскопа. В него проникает только свет, рассеянный объектом. Поэтому на темном фоне препарата наблюдаются ярко светящиеся контуры микробных клеток и других частиц. Микроскопия в.темном поле зрения позволяет определить форму микроба и его подвижность. Обычно темнопольную микроскопию используют при исследовании микроорганизмов, которые слабо поглощают свет и не видны в световом микроскопе, как, например, спирохеты. Для создания темного поля можно также использовать обычный конденсор Аббе, поместив в центр его кружок черной бумаги. В этом случае свет устанавливают и центрируют по световому полю, а затем затемняют конденсор Аббе. Препарат для микроскопии готовят по методу раздавленной капли. Толщина предметного стекла не должна превышать 1 - 1,1 мм, иначе фокус конденсора придется в толщу стекла. Между конденсором и предметным стеклом помещают жидкость (дистиллированная вода) с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. При правильной установке освещения на темном поле видны яркие светящиеся точки.
Фазово-контрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным - светлое изображение объекта на темном фоне.
Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители. Глаз человека может улавливать изменения длины волны и интенсивности видимого света только при исследовании непрозрачных объектов, проходя через которые, световые волны равномерно или неравномерно ослабляются, т. е. меняют величину амплитуды. Такие объекты называются амплитудными. Обычно это фиксированные и окрашенные препараты микроорганизмов или срезы тканей. Живые клетки вследствие высокого содержания в них воды слабо поглощают свет, поэтому почти все компоненты их прозрачны.
Метод фазово-контрастной микроскопии основан на том, что живые клетки и микроорганизмы, слабо поглощающие свет, тем не менее способны изменять фазу проходящих через них лучей (фазовые объекты). В разных участках клеток, отличающихся показателем преломления и толщиной, изменение фаз будет неодинаковым. Эти разности фаз, возникающие при прохождении видимого света через живые объекты, можно сделать видимыми с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Фазово-контрастная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа и специального приспособления, куда входят фазово-контрастный конденсор с кольцевыми диафрагмами и фазовая пластинка, имеющая форму кольца. Для первоначальной наводки используют вспомогательный микроскоп, с помощью которого добиваются того, чтобы через кольцевую диафрагму конденсора в объектив проникало лишь кольцо света. Луч света, пройдя через прозрачный объект, расщепляется на два луча: прямой и дифрагированный (преломленный). Прямой луч, проникнув через частицу, фокусируется на кольце фазовой пластинки, а дифрагированный луч как бы огибает частицу, не проходя через нее. Поэтому оптические пути их различны и между ними создается разность фаз. Она сильно увеличивается с помощью фазовой пластинки и благодаря этому контрастность изображения повышается, что позволяет наблюдать не только фазовые объекты целиком, но и детали строения, например, живых клеток и микроорганизмов.
Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.
16. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам(антибиотикограммы) обычно применяют:
Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков).Метод дисков - качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.
Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Этоколичественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов.
Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.
Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией.
На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.
Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10 6 -10 7 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий, под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.
Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.
К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков.К умеренно устойчивым относятся штаммы , для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.Устойчивыми являются микроорганизмы , рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.
Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом - исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина - Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18-20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024х0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.
Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).
Многие наслышаны о микроскопических беспозвоночных тихоходках (близкий к членистоногим тип Tardigrada ), внешне напоминающих нечто среднее между надувным матрасом и плюшевым мишкой, которые и в воде не тонут, и космического излучения не боятся, и после криозаморозки оживают. Deinococcus radiodurans — «тихоходки» среди бактерий.
Хотя одноклеточные дейнококки сильно отличаются от своего эукариотического (имеющего ядра в клетках) многоклеточного собрата, они вовсе не уступают ему в живучести и могут выдерживать
Дозу радиации до 10 тыс. Грей (для человека доза 5 Грей смертельна), высушивание и химическое воздействие.
«О молекулярных механизмах регуляции экспрессии генов у этой бактерии известно относительно мало, — рассказывает Андрей Кульбачинский, профессор РАН, заведующий лабораторией в Институте молекулярной генетики РАН. — Мы исследовали уникальные белки этой бактерии, которые регулируют активность РНК-полимеразы — главного фермента, ответственного за считывание генетической информации с матрицы ДНК. Было показано, что эти белки (Gfh-факторы) способны останавливать РНК-полимеразу в определенных участках генома, что может играть важную роль в изменении активности генов и «починке» ДНК, поврежденной радиацией. Похожие механизмы регуляции активности РНК-полимеразы могут действовать и у многоклеточных организмов». Работа поддержана грантом Российского научного фонда (РНФ) и была опубликована в журнале PNAS .
Как радиация вредит клетке
Открыты Deinococcus radiodurans были случайно: в 1956 году их нашли «в добром здравии» в банке с мясными консервами, которые пытались простерилизовать с помощью радиации.
В норме любое ионизирующее излучение — поток заряженных или нейтральных частиц или квантов, который способен превращать нейтральные атомы в заряженные ионы, возбуждая их, — разрушает гармонию слаженного механизма химических превращений, которые происходят в живой клетке.
Непреодолимые химические силы начинают тянуть ионизированные атомы к «соседям», к которым в невозбужденном состоянии они были абсолютно «равнодушны». Даже безопасные и вездесущие нейтральные молекулы воды могут превратиться в пероксид и затем в супероксид — опасные свободные радикалы, один из основных источников повреждений биологических молекул в клетке. Действие свободных радикалов называют оксидативным стрессом, так как оно связано с окислением биомолекул.
Результат — случайные химические связи, молекулярная неразбериха и «разрушение традиционных ценностей». Внутри живой клетки главным «хранителем традиций» является ДНК, в которой в закодированном виде содержится инструкция по сборке всех ее белков, важнейших участников основных клеточных процессов. Поэтому радиация (как и многие токсичные вещества), нарушающая последовательность ДНК, несет для клеток смертельную опасность: некоторые мутации могут случайно оказаться полезными, но, если не глядя переставлять детали в исправно работающем сложном механизме, вероятность сломать его несоизмеримо выше, чем вероятность изобрести что-то хорошее.
Кроме того, в ДНК могут образовываться разрывы, мешающие считыванию кода. «Ломаются» и сами белки — особенно часто повреждается SH-группы в цистеине (одной из аминокислот — «кирпичиков», из которых строится молекула белка), что нарушает их функции.
Восстать из радиоактивного пепла
Как же бактерии выживают в таких условиях? Повреждения ДНК живых организмов не всегда приводят к плачевным последствиям. В клетках есть специальные механизмы репарации — «ремонта» драгоценной молекулы, например одну из ее цепей можно достроить, «подглядывая» во вторую на том же участке и подбирая нуклеотиды («буквы» генетического кода) по принципу комплементарности, то есть подставляя на место отсутствующего фрагмента парные ему «буквы».
ДНК Deinococcus radiodurans упакована в две кольцевые хромосомы и две плазмиды — сравнительно маленькие дополнительные кольцевые молекулы ДНК. Каждая такая молекула представлена в количестве от четырех до десяти копий в любой момент жизни клетки, поэтому запасных вариантов для «сверки» у нее всегда много (а не всего две, как у нас в соматических клетках). Более того, оказалось, что основная опасность для жизни дейнококка — это не повреждение ДНК (которую можно починить, используя дополнительные копии), а как раз разрушение структуры белков, занимающихся ее ремонтом.
Для «починки» разрывов в ДНК бактерия имеет дополнительные белки: одни связываются с одиночной цепью ДНК при разрыве, чтобы защитить ее от дальнейших повреждений, другие, работая как «клеточная полиция», ловят «возмутителей спокойствия», свободные радикалы, и расщепляют их.
Кроме того, у всех бактерий есть дополнительные «хитрости», позволяющие вносить корректуры прямо в ходе транскрипции — считывания «ДНК-текстов». Однако есть ли какие-то особенности этого процесса у Deinococcus radiodurans, до последнего времени было неизвестно.
Один из механизмов, который основан на работе белков Gfh и может играть роль в процессах «ремонта» ДНК и защите клеток от радиации, и был исследован российскими учеными из . «Двое из трех соавторов, включая меня самого, работают также на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета , — сообщает Андрей Кульбачинский. — Исследования были выполнены исключительно за счет гранта РНФ, темой которого является изучение механизмов регуляции транскрипции и их возможной роли в радиоустойчивости Deinococcus radiodurans».
Хитрости редактуры
РНК-полимераза считывает информацию с ДНК, переводя ее в РНК — более короткую молекулу, которая в зависимости от последовательности будет служить матрицей для синтеза белка или выполнять еще множество функций в клетке. РНК-полимераза является также корректором или даже «главным редактором», исправляющим ошибки этого «перевода» (транскрипции).
Ведущий автор работы рассказал, какую роль в этом процессе могут играть изученные командой российских исследователей белки Gfh-факторы. Эти белки были обнаружены только у экстремофильных (живущих в неблагоприятных, с нашей точки зрения, условиях — при высоких температурах, давлении и др.) бактерий из группы Deinococcus-Thermus, которые очень устойчивы к нагреванию и другим стрессовым воздействиям.
«РНК-полимераза — один из самых консервативных ферментов в эволюции, и структура его во многом похожа и у бактерий, и у человека. В то же время различные организмы используют самые разнообразные способы регуляции работы этого фермента.
Одной из наиболее интересных групп регуляторных факторов являются белки, которые способны напрямую воздействовать на активный центр РНК-полимеразы. Для этого они связываются в специальном канале, который соединяет поверхность РНК-полимеразы с активным центром (так называемый вторичный канал — в отличие от первичного, в котором происходит связывание ДНК и РНК)», — рассказывает Андрей Кульбачинский.
По словам ученого, у большинства бактерий встречаются Gre-белки, относящиеся к этой группе. Они могут переключать активность РНК-полимеразы, в результате чего уже «прочитанный» фрагмент (транскрипт) расщепляется. Это свойство позволяет исправлять уже сделанные в ходе транскрипции ошибки. После такой «редактуры» РНК может синтезироваться дальше. У эукариот (в том числе у человека) тоже существуют аналоги таких белков, только эволюционное происхождение они имеют иное. Это говорит об исключительной важности такого процесса.
«Исследованные нами факторы — Gfh-белки — являются родственниками (гомологами) Gre-факторов. Однако вместо того, чтобы переключать активности РНК-полимеразы, они ее ингибируют! Причем у той бактерии, которую мы исследуем (Deinococcus radiodurans), это происходит только в определенных участках генома и только в присутствии ионов марганца, которые, как уже довольно давно известно, играют роль в защите клеток дейнококка от окислительного стресса», — сообщает ученый.
Перспективы: помогут ли Gfh-факторы «бороться с бактериями их же оружием»?
Исследователи сделали предположение, что Gfh-белки могут «фиксировать» РНК-полимеразу в определенном структурном состоянии, останавливая ее ход по молекуле ДНК. Такую «замершую над ошибкой» РНК-полимеразу узнают другие белки — факторы репарации («починки») и репликации (воспроизведения) ДНК. Дальнейшей задачей ученых станет исследование роли Gfh-белков в защите дейнококков от радиации.
«Наша работа носит прежде всего фундаментальный характер: впервые обнаружено, что регуляторные факторы способны значительно усиливать паузы и терминацию (остановку. — «Газета.Ru») транскрипции, связываясь во вторичном канале РНК-полимеразы. Так как строение РНК-полимеразы очень консервативно, весьма вероятно, что данный способ регуляции может действовать у самых разных организмов (например, и у нас с вами), только с участием других регуляторных факторов», — комментирует Андрей Кульбачинский.
Автор добавляет, что возможно и практическое применение результатов исследования. Так как Gfh-факторы фиксируют РНК-полимеразу и останавливают транскрипцию, то, изучив их, можно создать или найти другие молекулы, способные помешать бактериям переписывать информацию с ДНК на РНК и синтезировать белки. РНК-полимераза медленно изменяется с течением времени, поэтому у бактерий она очень похожа и ее удобно использовать как мишень для антибактериальных препаратов. Так, антибиотик рифампицин , используемый в борьбе с палочкой Коха, вызывающей туберкулез, подавляет именно РНК-полимеразу бактерий (правда, со временем они вырабатывают к нему устойчивость, что делает получение новых антибиотиков важнейшей проблемой ближайшего будущего).
ования. Интервал температур, при котором возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум - от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.
Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10- 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.
При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250-300 °С и давлении 262 атм. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как показатель загрязненности почвы.
Температурный фактор учитывают при проведении стерилизации. Вегетативные формы бактерий погибают при температуре 60 °С в течение 20-30 мин; споры - в автоклаве при 120 °С под давлением пара.
Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (-173 °С).
Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты. Так, бактерии туберкулеза в мокроте выдерживают высушивание до 90 дней. Устойчивы к высушиванию некоторые капсуло- и слизеобразующие бактерии. Но особой устойчивостью обладают споры бактерий.
Высушивание под вакуумом из замороженного состояния - лиофилизацию - используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.
Действие излучения. Неионизирующее излучение - ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение - гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабораториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200-450 нм.
Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была выделена из ядерного реактора.
Действие химических веществ. Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Процесс уничтожения микроорганизмов в окружающей среде называется дезинфекцией. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицид-ным, фунгицидным действием и т.д.
Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсо-держащим соединениям и окислителям. В хлорсодержащих препаратах бактерицидным действием обладает хлор. К этим препаратам относят хлорную известь, хлорамины, пантоцид, неопан-тоцид, натрия гипохлорит, гипохлорит кальция, дезам, хлорде-зин, сульфохлорантин и др. Перспективными антимикробными препаратами на основе йода и брома считаются йодопирин и дибромантин. Интенсивными окислителями являются перекись водорода, калия перманганат и др. Они оказывают выраженное бактерицидное действие.
К фенолам и их производным относят фенол, лизол, лизо-ид, креозот, креолин, хлор-р-нафтол и гексахлорофен.
Выпускаются также бактерицидные мыла: феноловое, дегтярное, зеленое медицинское, «Гигиена». Мыло «Гигиена» содержит 3-5% гексахлорофена, обладает наилучшими бактерицидными свойствами и рекомендуется для мытья рук сотрудников инфекционных больниц, родильных домов, детских учреждений, предприятий общественного питания и микробиологических лабораторий.
Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли, бура); спирты (70-80° этанол и др.); альдегиды (формальдегид, р-пропиолактон).
Перспективной группой дезинфицирующих веществ являются поверхностно-активные вещества, относящиеся к четвертичным соединениям и амфолитам, обладающие бактерицидными, моющими свойствами и низкой токсичностью (ниртан, амфо-лан и др.).
Для дезинфекции точных приборов (например, на космических кораблях), а также оборудования и аппаратуры используют газовую смесь из оксида этилена с метилбромидом. Дезинфекцию проводят в герметических условиях.
Влияние биологических факторов. Микроорганизмы находятся друг с другом в различных взаимоотношениях. Совместное существование двух различных организмов называется симбиозом (от греч. simbiosis - совместная жизнь). Различают несколько вариантов полезных взаимоотношений: метабиоз, мутуализм, комменсализм, сателлизм.
Метабиоз - взаимоотношение между микроорганизмами, при котором один микроорганизм использует для своей жизнедеятельности продукты жизнедеятельности другого организма. Метабиоз характерен для почвенных нитрифицирующих бактерий, использующих для метаболизма аммиак - продукт жизнедеятельности аммонифицирующих почвенных бактерий.
Мутуализм - взаимовыгодные взаимоотношения между разными организмами. Примером мутуалистического симбиоза являются лишайники - симбиоз гриба и сине-зеленой водоросли. Получая от клеток водоросли органические вещества, гриб в свою очередь поставляет им минеральные соли и защищает от высыхания.
Комменсализм (от лат. commensalis - сотрапезник) - сожительство особей разных видов, при котором выгоду из симбиоза извлекает один вид, не причиняя другому вреда. Комменсалами являются бактерии, представители нормальной микрофлоры человека.
Сателлизм - усиление роста одного вида микроорганизма под влиянием другого микроорганизма. Например, колонии дрожжей или сарцин, выделяя в питательную среду метаболиты, стимулируют рост вокруг них колоний микроорганизмов. При совместном росте нескольких видов микроорганизмов могут активизироваться их физиологические функции и свойства, что приводит к более быстрому воздействию на субстрат.
Антагонистические взаимоотношения, или антагонистический симбиоз, выражаются в виде неблагоприятного воздействия одного вида микроорганизма на другой, приводящего к повреждению и даже к гибели последнего. Микроорганизмы-антагонисты распространены в почве, воде и организме человека и животных. Хорошо известна антагонистическая активность представителей нормальной микрофлоры толстого кишечника человека - бифидобактерии, лактобацилл, кишечной палочки и др., являющихся антагонистами гнилостной микрофлоры.
Механизм антагонистических взаимоотношений разнообразен. Распространенной формой антагонизма является образование антибиотиков - специфических продуктов обмена микроорганизмов, подавляющих развитие микроорганизмов других видов. Существуют и другие проявления антагонизма, например большая скорость размножения, продукция бактериоцинов, в частности колицинов, продукция органических кислот и других продуктов, изменяющих рН среды.
4.7. Микрофлора растительного лекарственного сырья, фитопатогенные микроорганизмы, микробиологический контроль лекарственных средств
Растительное лекарственное сырье может обсеменяться микроорганизмами в процессе его получения: инфицирование происходит через воду, нестерильную аптечную посуду, воздух производственных помещений и руки персонала. Обсеменение происходит также за счет нормальной микрофлоры растений и фи-топатогенных микроорганизмов - возбудителей заболеваний растений. Фитопатогенные микроорганизмы способны распространяться и заражать большое количество растений.
Микроорганизмы, развивающиеся в норме на поверхности растений, относятся к эпифитам (греч. epi - над, phyton - растение). Они не наносят вреда, являются антагонистами некоторых фитопатогенных микроорганизмов, растут за счет обычных выделений растений и органических загрязнений поверхности растений. Эпифитная микрофлора препятствует проникновению фитопатогенных микроорганизмов в растительные ткани, усиливая тем самым иммунитет растений. Наибольшее количество эпифитной микрофлоры составляют грамотрицательные бактерии Erwinia herbicola, образующие на мясопептонном агаре золотисто-желтые колонии. Эти бактерии являются антагонистами возбудителя мягкой гнили овощей. Обнаруживают в норме и другие бактерии - Pseudomonas fluorescens, реже Bacillus mesentericus и небольшое количество грибов. Микроорганизмы находятся не только на листьях, стеблях, но и на семенах растений. Нарушение поверхности растений и их семян способствует накоплению на них большого количества пыли и микроорганизмов. Состав микрофлоры растений зависит от вида, возраста растений, типа почвы и температуры окружающей среды. При повышении влажности численность эпифитных микроорганизмов возрастает, при понижении влажности - уменьшается.
В почве, около корней растений, находится значительное количест
Влияние физических факторов
Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) - мезофилами, при высокой - термофилами.
К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов - обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при температуре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свойства бактерий меняются. Интервал температур, при котором возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум - от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.
Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10- 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.
При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250-300 °С и давлении 262 атм.
Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как показатель загрязненности почвы.
Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (-173 °С).
Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.
Высушивание под вакуумом из замороженного состояния - лиофилизацию - используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.
Действие излучения
Неионизирующее излучение - ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение - гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабораториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200-450 нм.
Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была выделена из ядерного реактора.
Действие химических веществ
Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.
Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим соединениям и окислителям.
Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли).
Стерилизация – предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергшихся обработке.
Дезинфекция - процедура, предусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтожения до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании данного предмета. Как правило, при дезинфекции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии.
Асептика – комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для борьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители.
Антисептика – совокупность мер, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалительного процесса.
